Potenciálně důležitá studie, která otevírá nové pohledy na účinky infračerveného světla na tkáň, včetně periferní nervové tkáně.
Optická stimulace významně pokročila ve studiu mozkových funkcí a dalších biologických procesů. Zároveň má extrémně široký potenciál pro terapeutické využití, od obnovy sluchu až po normalizaci srdečního rytmu. Zejména pulzní laserová stimulace využívající infračervené vlnové délky >1,5 μm je schopna přímo stimulovat nervy a svaly bez předchozího genetického nebo chemického zásahu, čehož lze využít v terapii. Mechanismus infračervené stimulace byl však záhadou, což bránilo jeho implementaci v klinické praxi.
V této práci autoři demonstrují, že infračervené světlo excituje buňky dříve neznámým elektrostatickým mechanismem společným pro různé buňky. Infračervené pulsy jsou absorbovány vodou, což způsobuje rychlé místní zvýšení teploty. Takové zahřívání reverzibilně mění elektrickou kapacitu plazmatické membrány, což vede k její depolarizaci. Tato změna potenciálu je zcela vratná a pro její realizaci stačí pouze nejzákladnější fyzikální a chemické vlastnosti buněčných membrán.
Výsledky studie zdůrazňují obecnou použitelnost pulzní infračervené stimulace a její medicínský potenciál.
Optické technologie, které umožňují přesnou lokální aktivaci nervové nebo svalové aktivity, hrají stále důležitější roli v neurovědách a ve vývoji léčby neurologických, psychiatrických a kardiovaskulárních onemocnění. Většina těchto technologií vyžaduje senzibilizaci cílové tkáně pomocí genu nebo chemického činidla citlivého na světlo, což zvyšuje technickou náročnost a riziko jejich aplikace, zejména v klinickém prostředí.
Na rozdíl od toho se ukázalo, že pulzní infračervené laserové světlo je schopno stimulovat neurony a další excitabilní buňky in vivo bez jakékoli předchozí genetické nebo chemické přípravy. Výzkum lze provádět minimálně invazivním způsobem, protože záření s požadovanou vlnovou délkou lze přenášet přes optické vlákno. Infračervenou stimulací lze ovlivnit motorické větve míšních a hlavových nervů, kavernózních nervů prostaty, vestibulokochleárního nervu a myokardu. Snadné použití přímé infračervené excitace činí tuto metodu atraktivní pro použití v široké škále vědeckých a klinických situací, od obnovení sluchu až po normalizaci srdce.
Studie na zvířatech poskytují stále více důkazů, že infračervená stimulace může být použita k modulaci různých biologických funkcí. Navzdory tomu není mechanismus jeho působení plně objasněn. Ukázalo se, že infračervená stimulace je doprovázena rychlým zvýšením teploty tkáně, což pravděpodobně excituje buňky působením na iontové kanály a aktivací intracelulárních druhých poslů, čímž se zvyšuje vodivost membrány. Přímé důkazy ve prospěch jednoho z navrhovaných mechanismů zatím nebyly získány. Je to částečně proto, že většina experimentů s infračervenou stimulací zkoumala její konečné účinky (např. vytváření akčního potenciálu a svalovou kontrakci) spíše než mezilehlé elektrofyziologické změny v cílových buňkách.
Autoři studie zkoumali mechanismus infračervené stimulace oocytů Xenopus laevis, kultivovaných savčích buněk a umělých lipidových dvojvrstev a popsali dosud neznámý obecný mechanismus, ve kterém pulsy infračerveného laseru absorbované vodou vedou k rychlému lokálnímu zvýšení teploty, což dočasně zvyšuje elektrická kapacita membrány a vede k její depolarizaci. Objev pomůže dále studovat infračervenou stimulaci nervového systému a dalších orgánů a vyvolává otázky o účincích jiných typů světla na buněčnou signalizaci.
Infračervené světlo indukuje depolarizační proudy v oocytech X. laevis
Velká velikost oocytů X. laevis (~1 mm) umožňuje simultánní záznam elektrofyziologických parametrů a optickou stimulaci, přičemž riziko fotoelektrických artefaktů zůstává minimální. Na základě předchozích výsledků ukazujících, že infračervené záření zvyšuje buněčnou excitabilitu, autoři stimulovali připravené oocyty exprimující napěťově řízené sodíkové (Na+) a draslíkové (K+) kanály infračervenými laserovými pulzy. Na rozdíl od očekávání pozorovaný efekt nezávisel nejen na typu iontových kanálů, ale také na expresi kanálů obecně: přetrvával i při stimulaci oocytů divokého typu (které exprimují mnohem méně iontových kanálů než trénované).
Infračervené světlo indukuje depolarizační proudy v savčích buňkách
Aby vědci zjistili, zda je reakce oocytů na stimulaci jedinečná pro tento typ buněk, provedli experimenty s infračervenou stimulací na buňkách HEK. Laserové pulsy 200 μs (0,7 mJ) a 1 ms (3,7 mJ) způsobily membránové proudy podobné těm, které byly pozorovány u oocytů. Maximální proudové amplitudy 73 ± 20 pA byly pozorovány při 1 ms pulzech. Vzhledem k malé velikosti buněk HEK vzhledem k průměru optického vlákna a hloubce průniku světla byly jak buňka, tak záznamová pipeta ozařovány světelnými pulzy. Avšak nahrazení H2O v extracelulárním roztoku D2O snížilo pozorovanou aktuální odezvu v HEK buňkách o 75,8 ± 12,6 %.
Infračervené světlo mění kapacitu umělých dvojvrstev
Pozorování indukovaných proudů v oocytech a buňkách HEK a absence změn v odpovědi při přidání blokátorů kanálů a transportérů vedly autory k myšlence, že za takovou reakci na stimulaci je zodpovědný mechanismus společný všem typům membrán. Autoři zejména poznamenali, že reakce nezávisí na absolutní teplotě, ale na rychlosti její změny. To naznačuje, že teplota mění elektrickou kapacitu membrány a vytváří proud úměrný derivaci kapacity.
Potenciální výhody infračervené stimulace byly prokázány četnými studiemi in vivo, ale nedostatek znalostí o jejích základních mechanismech brzdil pokrok směrem k důležitým vědeckým a klinickým aplikacím. Autoři této studie objevili důležitý, dříve neznámý mechanismus infračervené stimulace způsobené přechodnými změnami elektrické kapacity membrán.
Všechny tři modely vykazovaly podobné elektrofyziologické odezvy na infračervenou stimulaci indukovanou laserovými pulzy. Tyto proudy byly zcela vratné a snadno reprodukovatelné. Po normalizaci dat pro energii pulzu, počáteční náboj membrány a přibližnou oblast ozáření bylo zjištěno, že změny náboje membrány jsou podobné v oocytech, buňkách HEK a umělých dvojvrstvách. Tyto údaje naznačují, že v těchto třech systémech existuje společný mechanismus pro změnu elektrické kapacity membrány a k dosažení efektu jsou zapotřebí pouze nejzákladnější prvky buněčné membrány, představované umělou dvojvrstvou. V souladu s tímto závěrem je zřejmé, proč se reakce oocytů během aktivní činnosti napěťově řízených kanálů nezměnila a nebyla vyrovnána, když byly buňky ošetřeny blokátory iontových kanálů.
Proudy ve všech třech systémech výrazně poklesly při nahrazení H2O D2O. To přímo potvrzuje, že voda je hlavním chromoforem zapojeným do infračervené stimulace buněčné membrány. Časový profil změn teploty zprostředkovaných vodou ukazuje rychlý, téměř lineární nárůst během laserového pulsu, následovaný pomalejším exponenciálním poklesem konzistentním s dobou přenosu tepla z vody.
Literatura o optické stimulaci buněk přehlédla možnost kapacitního mechanismu. Teplotní změna kapacity membrány však není překvapivá vzhledem k jejich fyzikálním vlastnostem. Kapacita je určena ionty, jejichž umístění v blízkosti membrány závisí na rovnováze elektrických a tepelných sil. Implementace klasické teorie dvouvrstvých kondenzátorů tedy vytvořila předpovědi, které byly z velké části potvrzeny daty v umělých dvojvrstev a jsou v souladu s ranou prací na obřích axonech olihně, která ukazuje, že vyšší teploty vedly ke zvýšení kapacitance membrány, a pozorování, že světlo- indukované teplotní skoky v oocytech byly indukovány nábojové vytěsňovací proudy. Výsledky nevylučují možnost, že roli hrají i další potenciální kapacitní jevy, jako jsou změny mechanického tlaku. Takové potenciální příspěvky budou vyžadovat další studium.
